产品货号：
YTB4162
中文名称：
南极磷酸酶(热敏性)
英文名称：
Antarctic Phosphatase(Thermosensitive)
产品规格：
1kU|5kU
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本制品是一种源自南极微生物的、热敏感的重组表达纯化的磷酸酶，可以催化去除DNA、RNA、dNTP、rNTP 5'或3'末端磷酸基团。DNA或RNA 5'端脱去磷酸基团(简称脱磷或去磷)后就不能被连接酶(ligase)所连接，常用于避免载体的自连、提高基因克隆时的阳性率、选择性连接特定序列等。南极磷酸酶也可以脱去蛋白质丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上的磷酸基团。
南极磷酸酶(Antarctic Phosphatase)是一种新型碱性磷酸酯酶，在多种内切酶和PCR缓冲液中可保持不低于100%的活性，对于各种类型的DNA 5'末端的去磷酸化均可在37℃孵育15分钟即可完成，并且75℃孵育5分钟即可完全失活。
经限制性内切酶酶切的质粒5'端带有磷酸基团，在进行基因克隆时为避免质粒自连，可以使用南极磷酸酶去除5'末端磷酸基团。脱去5'末端磷酸基团的质粒不能发生自连。
- 快速去磷酸化：只需37℃孵育15分钟即可。
- 快速失活：75℃孵育5分钟即可完全失活。
- 使用方便：在各种内切酶和PCR缓冲液中保持不低于100%的活性，可以和质粒DNA的酶切等同时进行。
- 兼容性强：对于5'或3'突出末端、平端等各种DNA的脱磷酸化采用完全相同的操作步骤。
- 适用于后续的连接反应：经南极磷酸酶脱磷酸基团，并75℃孵育5分钟失活后，通过柱纯化或凝胶电泳后切胶回收纯化等适当处理后，可用于后续的连接反应。
- 通过去除载体或DNA片段5'末端的磷酸基团，防止载体或DNA片段自连。
- 质粒DNA同时进行内切酶消化和脱磷。
- 通过5'末端脱磷，制备用于T4 PNK进行5'末端标记的DNA或RNA。
- 去除DNA、RNA、rNTP和dNTP的5'末端的磷酸基团。
- PCR产物中去除dNTP和焦磷酸根。
- 用于蛋白质丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基的去磷酸化。
大肠杆菌重组表达。南极磷酸酶通常会形成同源二聚体，其单体的分子量为35kD。
1μg线性化的pUC19在37℃孵育30分钟可以导致后续的自连反应抑制率达到95%以上定义为一个活力单位。
| 组分 | 1kU | 5kU |
| 南极磷酸酶(5U/μL) | 200μL | 1mL |
| 10×AntP Reaction Buffer | 500μL | 2mL |
保存：-20℃
10mM Tris-HCl (pH7.4)，1mM MgCl2，0.1mM ZnCl2，50% (v/v) glycerol。
10×AntP Reaction Buffer：
500mM Bis-Tris-Propane HCl，10mM MgCl2，1mM ZnCl2，pH6.0。
不含DNA外切酶和内切酶，不含RNA酶。
- 75℃加热5分钟可使南极磷酸酶充分失活。
- EDTA等金属离子螯合剂对南极磷酸酶有抑制作用。
- 南极磷酸酶与其它碱性磷酸酶相同，其酶活性需要有Zn2+和Mg2+的存在。反应中加入1/10体积的10×AntP Reaction Buffer，能够提供足够的Zn2+和Mg2+等以保证酶的活性。
- 南极磷酸酶在NEB buffers 1、2、3、4和CutSmart缓冲液中时，必须同时加入10×AntP Reaction Buffer才有活性。
- 南极磷酸酶在单价盐离子存在时活性增强。
- 南极磷酸酶在EDTA等金属离子螯合剂、无机磷酸盐及磷酸盐类似物存在时，其活性被抑制。
- 南极磷酸酶在DTT、巯基乙醇等还原剂存在时，其活性会降低。
- 本使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后该立即放置于-20℃保存。
- 本制品75℃灭活前后的酶活对比(参见图1)。
图1．本制品75℃灭活前后的酶活对比。以pNPP为底物进行比色法测定，灭活采用75℃加热处理5分钟。反应体系为：50μL底物缓冲液(10mM pNPP等)，2μL稀释125倍后的南极磷酸酶(圆形和三角形图标分别代表是否经过75℃加热处理5分钟的酶)。混匀后室温反应20分钟，每隔1min测定一次OD405。 - 本制品对单酶切后的载体进行脱磷处理可以大大降低载体单酶切后的自连率(参见图2)。
图2．本制品对BamHI单酶切后的pUC18载体进行脱磷处理可以大大降低载体自连。
A：pUC18质粒经BamHI单酶切过夜，不使用南极磷酸酶进行脱磷处理，然后载体用T4 DNA连接酶进行连接、转化DH5α的实验结果。
B：pUC18质粒经BamHI单酶切，使用南极磷酸酶在37℃脱磷处理15分钟，75℃灭活处理5分钟，然后载体用T4 DNA连接酶进行连接、转化DH5α的实验结果。本制品处理后可以使大于95%的单酶切质粒脱磷而避免自连。 - 本制品对双酶切后的载体进行脱磷处理可以大大提高克隆的阳性率(参见图3)。
图3．本制品对EcoRI/BamHI双酶切后的pUC18载体进行脱磷处理可以大大提高克隆的阳性率。
A、C：经EcoRI/BamHI双酶切过夜的pUC18质粒未做脱磷处理，加入EcoRI/BamHI双酶切后600bp的PCR产物片段，然后用T4 DNA连接酶进行连接、转化DH5α的实验结果(A)及从该平板挑取10个单克隆、使用pUC18通用引物、进行菌落PCR的实验结果(C)；
B、D：经EcoRI/BamHI双酶切的pUC18质粒使用南极磷酸酶在37℃脱磷处理15分钟，75℃灭活处理5分钟，柱纯化后加入经EcoRI/BamHI双酶切的后600bpPCR产物片段，然后用T4 DNA连接酶进行连接、转化DH5α的实验结果(B)及从该从平板挑取10个单克隆、使用pUC18通用引物、进行菌落PCR的实验结果(D)。
- 南极磷酸酶在酶切反应中对质粒DNA 5'末端去磷酸化：
- 参考如下表格设置去磷酸化反应：
成分 用量 质粒DNA 1μg 内切酶的Reaction Buffer(10×) 2μL 无核酸酶去离子水 至19μL 内切酶 1μL - 按上述体系设置好之后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀一下)，随后离心沉淀液体至管底。
- 37℃孵育60分钟或根据内切酶说明书推荐的最适条件进行酶切反应。
- 向酶切体系中加入1μL南极磷酸酶(5U/μL)，37℃孵育15分钟。如果希望获取更好的去磷酸基团效果，也可以延长孵育时间至60分钟，但通常孵育15分钟已经足够。
- 75℃加热5分钟，对南极磷酸酶和限制性内切酶用热失活的方法终止反应。
- 如果后续用于连接反应，可以使用适当的PCR产物DNA纯化试剂盒纯化或琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行凝胶电泳后的切胶回收纯化，也可以使用酚氯仿抽提、乙醇沉淀等方法纯化已消化并且脱磷酸化的DNA或RNA。
- 参考如下表格设置去磷酸化反应：
- DNA、RNA的5'或3'末端脱磷
- 参考如下表格设置去磷酸化反应：
成分 用量 待脱磷的DNA或RNA 1～5μg(≤10pmol termini) 10×AntP Reaction Buffer 2μL 无核酸酶去离子水 至19μL 南极磷酸酶(5U/μL) 1μL - 按上述体系设置好之后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀一下)，随后离心沉淀液体至管底。
- 37℃孵育15分钟。如果希望获取更好的去磷酸基团效果，也可以延长孵育时间至60分钟，但通常孵育15分钟已经足够。
- 75℃加热5分钟失活南极磷酸酶。
- 后续如有必要，可以使用适当的PCR产物DNA纯化试剂盒纯化或琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行凝胶电泳后的切胶回收纯化，也可以使用酚氯仿抽提、乙醇沉淀等方法纯化已消化并且脱磷酸化的DNA或RNA。
说明：上述脱磷反应可以用于5'突出的DNA，也可以用于平末端DNA，反应条件相同，即均为37℃孵育15分钟。
- 参考如下表格设置去磷酸化反应：
- 蛋白去磷酸化
- 参考如下表格设置去磷酸化反应：
成分 用量 待去磷酸化的蛋白 1～10μg 10×AntP Reaction Buffer 5μL 去离子水 至45μL 南极磷酸酶(5U/μL) 5μL - 按上述体系设置好之后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀一下)，随后离心沉淀液体至管底。
- 37℃孵育60分钟。
- 加入EDTA至终浓度为50mM或加入钒酸钠至终浓度为10mM以终止去磷酸化反应。
注意：酶的最佳用量和37℃的最佳孵育时间需根据特定蛋白自行进行优化。
- 参考如下表格设置去磷酸化反应：
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